基因治疗技术升级

从“病毒载体”到“基因组编辑”,还存在哪些问题？

在过去的10年里，基因治疗技术进一步成熟。安全性的改进、基因转化和传递效率的提高，促成了实质性的临床进展。

病毒载体：

γ逆转录病毒、慢病毒、AVV

重组的复制缺陷病毒载体是第一个可以有效将无毒的基因转移到人体体细胞的工具。其中，逆转录病毒和腺相关病毒（AAV）已显示出很大的临床前景。

1980年代末和1990年代初开发的γ逆转录病毒载体首先用于人类造血干细胞（HSC）。这些载体被用于第一代临床试验，旨在将一种特定缺陷基因的正常拷贝导入患者的T细胞或HSC基因组中。

随后，慢病毒和spumavirus也被添加到逆转录病毒系列中。与γ-逆转录病毒载体相比，慢病毒载体基因转化至非分裂细胞，并可携带更大更复杂的基因。慢病毒和spumavirus载体还具有γ-逆转录病毒载体所没有的另一个优点——可更多地融入基因的编码区。γ-逆转录病毒载体虽可融入基因5′非翻译区，但这个功能会增加在HSC中插入诱变的致癌风险。目前，慢病毒载体是大多数HSC应用的首选工具，但γ-逆转录病毒仍用于某些T细胞和HSC中。在病毒载体中使用“自我失活型”设计，是另一种减少基因毒性的风险的方法。

AAV载体是由一种复制缺陷的非致病性、无包膜的细小病毒设计而成。野生型AAV需要另一种病毒（如腺病毒或疱疹病毒）来复制。AAV载体的一个限制是不能承载多于5.0kb的DNA（而γ-逆转录病毒或慢病毒载体可容纳8kb）。AAV载体的优点是非融合转化的DNA被稳定地作为一个附加体。这一特性降低了与整合相关的风险，但也限制了AAV载体在有丝分裂后细胞的长期表达。此外，AAV载体还可有效地定向到多种靶组织，包括肝脏、视网膜、心肌和中枢神经系统。

基因组编辑：

Crispr-CAS9是大推手

与仅能介导一种基因修饰（基因添加）的病毒载体相比，新的基因组编辑技术可介导细胞中的基因添加、基因消除、基因校正和其他靶向基因组修饰。基因组编辑可在体外的细胞中进行，然后回输细胞；也可将编辑基因的系统输入活体内，实现组织原位基因编辑。

早期的基因组编辑研究依赖于每一个DNA靶点特异的锌指核酸酶（ZFN）以诱导所需的双链断裂。但ZFN平台需要为每个切割靶点定制DNA结合核酸酶效应蛋白，这限制了它们的广泛应用。

2009年，TALE核酸酶（TALEN）被发现，其基本上能有效地切割任何感兴趣的DNA序列，但仍需为每个新的DNA靶点设计一对特殊的核酸酶。

2012年，基因组编辑技术发生了重大变化，Doudna和Charpentier发现了具有开创性的Crispr-CAS9核酸酶技术，可在感兴趣的地点切割DNA，只需设计一个与目标地点互补的特定短指南RNA。CRISPR-CAS9可在单个碱基水平上纠正突变，也可打开和关闭基因。

基因组编辑方法为纠正或改变基因组提供了一个精确的“手术刀”，可克服依赖病毒载体介导的随机基因组插入缺点。其作为一种治疗手段正迅速进入临床。工程化ZFN被用来干扰人类T细胞和HSC中的CCR5表达，使这些细胞对HIV感染具有抵抗力。TALEN被用来使第三方抗CD19 CAR-T细胞降低移植物抗宿主病的发生。美国FDA已批准开展3项ZFN介导的肝细胞白蛋白位点插入治疗性基因的临床试验，包括血友病B的因子Ⅸ基因、α-L-iduronidase基因和iduronidate-2-sulfatase基因。

需要强调的是，与标准的基因转移方法相比，基因组编辑（尤其是基于CRISPR-Cas核酸的基因组编辑）还处于起步阶段，还存在一些可能影响临床应用的潜在可行性和安全性障碍。因此，需要在适当的模型和精心设计的临床试验中进行进一步的临床前研究。

目前正在研究的相关问题是：如何最好地设计核酸酶或指南RNA，以避免偏离目标的切割？如何预测、筛选和检测目标的偏离？值得注意的是，高保真度的CRISPR-Cas9核酸酶变体几乎没有可检测到的靶外效应。

基因组编辑的快速技术进步使可遗传的种系编辑（对生殖细胞、配子、合子或胚胎的改变，能将编辑后的基因传给后代）成为可能。不过，在美国，联邦政府基金目前不能用于生殖细胞编辑的研究，FDA也不批准临床试验。其他许多国家也存在类似的限制。

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